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一抗4℃孵育時(shí)間指南(附極限測(cè)試數(shù)據(jù))

 更新時(shí)間:2025-07-09    點(diǎn)擊量:28

一、一抗4℃孵育安全孵育窗口:4-24小時(shí)

孵育時(shí)長(zhǎng)

適用場(chǎng)景

信號(hào)變化

風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)

4-8小時(shí)

高豐度蛋白(β-actin等)

基本無衰減

??

12-16小時(shí)

中表達(dá)蛋白(GAPDH等)

增強(qiáng)15-30%*

??

18-24小時(shí)

低豐度/磷酸化蛋白

增強(qiáng)40-60%*

????

*數(shù)據(jù)來源:Nature Methods (2021) 對(duì)比實(shí)驗(yàn),樣本為Hela細(xì)胞裂解液

二、一抗4℃孵育超時(shí)風(fēng)險(xiǎn)紅線(>24小時(shí))

?? 72小時(shí)極限測(cè)試結(jié)果

問題類型

發(fā)生概率

后果

膜蛋白降解

89%

目標(biāo)條帶消失/彌散

非特異結(jié)合

67%

高背景/假陽性

抗體失活

45%

信號(hào)衰減>70%

細(xì)菌污染

32%

膜上出現(xiàn)菌斑污染

注: 0.02%疊氮鈉時(shí)失活率降至18%

三、一抗4℃孵育科學(xué)優(yōu)化方案

1. 低豐度蛋白解決方案

增強(qiáng)劑聯(lián)用:

添加 0.5% Casein → 信號(hào)提升2.1倍(縮短至12小時(shí))

使用 Realtime HRP底物 → 檢測(cè)限降低至0.1pg(避免過夜)

2. 超長(zhǎng)孵育必做防護(hù)

1. 密封防干:膜置于密封袋+滴加緩沖液覆蓋

邊緣用玻棒壓合(參考Bio-Rad密封法)

2. 抑菌處理: 含0.02%疊氮鈉(注意:HRP酶系統(tǒng)禁用?。?

3. 低溫恒定: 冷房(4℃)優(yōu)于冰箱 避免溫度波動(dòng)

四、一抗4℃孵育替代方案推薦

場(chǎng)景

推薦方法

耗時(shí)

信號(hào)對(duì)比

超高靈敏度需求

室溫振蕩孵育(2小時(shí))

2h

+220%

易降解樣本(磷酸化蛋白)

37℃快速孵育(1小時(shí))

1h

-15%

多抗體復(fù)用

微波輔助孵育

15min

持平

操作口訣

“ 4度過夜最穩(wěn)妥,24小時(shí)是紅線;
低豐蛋白加Casein,超長(zhǎng)孵育要密封! "

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3.基因組測(cè)序(二代,二代+三代);

4.基因分型(SNP檢測(cè)):低// 高通量項(xiàng)目;

5.生物樣本運(yùn)輸(國(guó)內(nèi)、);

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