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022-66387942一、一抗4℃孵育安全孵育窗口:4-24小時(shí)
孵育時(shí)長(zhǎng) | 適用場(chǎng)景 | 信號(hào)變化 | 風(fēng)險(xiǎn)等級(jí) |
4-8小時(shí) | 高豐度蛋白(β-actin等) | 基本無衰減 | ?? 低 |
12-16小時(shí) | 中表達(dá)蛋白(GAPDH等) | 增強(qiáng)15-30%* | ?? 低 |
18-24小時(shí) | 低豐度/磷酸化蛋白 | 增強(qiáng)40-60%* | ???? 中 |
*數(shù)據(jù)來源:Nature Methods (2021) 對(duì)比實(shí)驗(yàn),樣本為Hela細(xì)胞裂解液
二、一抗4℃孵育超時(shí)風(fēng)險(xiǎn)紅線(>24小時(shí))
?? 72小時(shí)極限測(cè)試結(jié)果
問題類型 | 發(fā)生概率 | 后果 |
膜蛋白降解 | 89% | 目標(biāo)條帶消失/彌散 |
非特異結(jié)合 | 67% | 高背景/假陽性 |
抗體失活 | 45% | 信號(hào)衰減>70% |
細(xì)菌污染 | 32% | 膜上出現(xiàn)菌斑污染 |
注: 含0.02%疊氮鈉時(shí)失活率降至18%
三、一抗4℃孵育科學(xué)優(yōu)化方案
1. 低豐度蛋白解決方案
增強(qiáng)劑聯(lián)用:
添加 0.5% Casein → 信號(hào)提升2.1倍(縮短至12小時(shí))
使用 Realtime HRP底物 → 檢測(cè)限降低至0.1pg(避免過夜)
2. 超長(zhǎng)孵育必做防護(hù)
1. 密封防干:膜置于密封袋+滴加緩沖液覆蓋
邊緣用玻棒壓合(參考Bio-Rad密封法)
2. 抑菌處理: 含0.02%疊氮鈉(注意:HRP酶系統(tǒng)禁用?。?
3. 低溫恒定: 冷房(4℃)優(yōu)于冰箱 → 避免溫度波動(dòng)
四、一抗4℃孵育替代方案推薦
場(chǎng)景 | 推薦方法 | 耗時(shí) | 信號(hào)對(duì)比 |
超高靈敏度需求 | 室溫振蕩孵育(2小時(shí)) | 2h | +220% |
易降解樣本(磷酸化蛋白) | 37℃快速孵育(1小時(shí)) | 1h | -15% |
多抗體復(fù)用 | 微波輔助孵育 | 15min | 持平 |
操作口訣
“ 4度過夜最穩(wěn)妥,24小時(shí)是紅線;
低豐蛋白加Casein,超長(zhǎng)孵育要密封! "
添加微信可領(lǐng):
《WB實(shí)驗(yàn)69個(gè)問題》word文檔
《1000生物個(gè)公司名錄》超全面總結(jié)excel
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(一)輻射五大服務(wù)方向:
1.國(guó)內(nèi)試劑耗材經(jīng)銷代理;
2.國(guó)外試劑訂購(gòu)(直訂,或境外代理);
3.基因組測(cè)序(二代,二代+三代);
4.基因分型(SNP檢測(cè)):低/中/中 高通量項(xiàng)目;
5.生物樣本運(yùn)輸(國(guó)內(nèi)、);
(二)多家代理品牌,涉及30多種較有名品牌,經(jīng)營(yíng)代理500多個(gè)品牌:
百奧益康、Qiagen、Sigma、R&D、Epigentek、ThermoFisher、DNA Genotek、USA Scientific、Matreya、Sage Science、List Labs、Macrocyclics、Steraloids、NIBSC、mobio、immunodx、cellsystems、medicago、abcam、CST、Roche、Bethyl、sino Biological、clodrosome、adi BIO-WORLD、TOKU-E、HYPHEN BioMed、moltox、ZeptoMetrix International Humic、biocytex、Toxin Technology、Streck、Elastin、biomax、Orflo Technologies、Accegen、Advbiomart、genlantis、Biocolor、Cygnus Technologies LLC、Enzyme Research、Bio/Data Corporation、Greer Lab 、Solarbio、bangslabs、bioline、musechem、Novocastra、hyphen-biomed、polyplus、moltox 、exiqon、pentapharm、verichemlabs、GenStar、ALZET、lucernatechnologies 、meridian、origene、horizondiscovery、Reagents、megazyme、elisasystems………
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